近期，许多同学向小尚反馈在细胞复苏过程中遇到困难。细胞复苏作为细胞培养中的一个重要环节，虽为常规操作，但其细节常常易被忽视。复苏的成败与冻存、复苏的操作流程息息相关，稍有不慎便可能导致重大的失误。

冻存步骤回顾

在探讨常见错误前，首先让我们回顾冻存的基本步骤：

1. 提前准备好冻存液备用。
2. 离心获得细胞沉淀后，加入冻存液，轻轻重悬细胞。
3. 将细胞悬液转移入冻存管。
4. 如使用程序冻存液，将冻存管置于程序冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜后，再转入液氮保存；若使用非程序冻存液，则无需冻存盒。

常见冻存错误

以下是冻存过程中常见的错误操作：

1. 忽视降温过程

使用常规含血清冻存液（培养基+血清+DMSO）时，未采取程序降温措施。快速降温会导致冰晶形成，进而使细胞破裂死亡。因此，需使用冻存盒来确保降温控制在1℃/min。目前市面上的程序冻存盒能够有效稳定温度。没有冻存盒的同学，可以将冻存管放在泡沫盒中，4℃静置5-10分钟后，再转入-20℃静置2小时，随后过夜保存在-80℃冰箱，再转入液氮。

2. 冻存细胞状态差

冻存前需确保细胞状态良好，最佳选择对数生长期、汇合度超过80%的细胞进行冻存。如果细胞培养液呈橘黄色，建议换液后再静置培养4小时。此外，冻存细胞的浓度应控制在200-300万/mL/管，具体可根据培养瓶的数量进行估算。

3. 直接加入DMSO

在处理细胞悬液时，直接加入DMSO而不提前配制冻存液，会因DMSO稀释时放热对细胞造成损伤。在进行细胞操作时，应提前配制好冻存液，以确保细胞的健康。

4. 温度骤降

将重悬的细胞直接放入液氮中是不科学的，因为液氮的温度为-196℃，必须经过-80℃的逐步降温过程，以避免细胞直接冻裂。

5. 不合适的冻存液配方

研究显示，5%-10%的DMSO最适合用于细胞冻存，具体比例需根据细胞种类进行调整。普通细胞系适用8%DMSO，而对于DMSO敏感的细胞，则需降低比例。此外，细胞培养难度越大，所需的血清比例也应相应增加。

6. 冻存条件不当

通常情况下，液氮储存的细胞稳定性优于-80℃冰箱。因冰箱频繁开关，温度波动会影响细胞活率，所以优先选择液氮进行保存。若没有液氮罐，可将冻存管放在-80℃冰箱内侧，并定期复苏监测细胞活性。

密切关注上述细节，合理使用PG电子相关产品，能够有效提升细胞复苏的成功率。下周，我们将更新复苏操作的原因排查，欢迎大家收藏关注。